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生物 质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

摘    要

质粒DNA(plasmid DNA)是最常用的基因工程和基因疫苗载体,近年来在生物医学和环境科学等领域得到了广泛应用。质粒DNA 纯化是分子生物学研究中常用的实验技术,纳米磁性粒子等固相载体技术和色谱技术优化了DNA 纯化方法。对大肠杆菌质粒DNA 常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进行综述,为质粒DNA的应用研究提供支持。

关键词

质粒DNA;内毒素;核酸自动纯化仪

质粒是染色体外能够自我复制的双链闭合环状DNA 分子,以超螺旋状态存在,几乎完全裸露,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒DNA广泛应用于基因工程、生物医学的研究以及生物产品的开发和应用。质粒DNA 纯化是其应用的关键步骤,直接影响到转化、测序、PCR、酶切和转染等下游实验。一般质粒DNA 约为2~20 kb,初步纯化的质粒DNA 构型分为超螺旋、开口环状及线性3 种,其中超螺旋结构的质粒DNA转化和表达效率最高。质粒DNA安全性好、毒性低和免疫原性较低、便于分离和提取,在DNA重组技术、转基因方面有广泛应用。

1 质粒DNA 常用纯化方法

质粒DNA 分离纯化的方法大致可分为两类:一是传统萃取抽提的液相法,如煮沸法、苯酚氯仿法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法等;二是固体介质法,如硅胶膜法、阴离子交换膜法及磁珠法等。后者操作步骤简便,提取纯度较好。

1.1 硅胶为基础的提取方法

硅胶可以吸附核酸,DNA分子与硅胶表面的相互作用主要包括静电作用、疏水作用、氢键作用等

[1]
。硅胶或二氧化硅为基础的方法是最常用的提取方法,常应用微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒的滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂和玻璃纤维
[2]
。在高浓度的离液盐,如盐酸胍和异硫氰酸胍等条件下,带负电荷的DNA和带正电荷的二氧化硅粒子有很高的亲和力,可用低离子强度的缓冲液或蒸馏水洗脱DNA。目前实验室多用带有硅基质膜的离心柱试剂盒操作。

1.2 磁基质为基础的提取方法

磁珠法是利用表面经过硅羟基修钸的复合磁性纳米微球提取核酸

[3]
,已在生物医学领域中广泛应用。用于核酸纯化的磁性微粒有Fe
3
O
4
/SiO
2
、Fe
3
O
4
/SiO
2
/TiO
2
[4]
。根据表面修饰基团可分为羟基
[5]
、羧基
[6]
、氨基
[7]
纳米磁珠和多聚乙烯亚胺
[8]
磁珠。磁珠法可同时处理多个样品,易实现自动化操作,特别适用于微量样本的DNA提取。

1.3 阴离子交换为基础的提取方法

阴离子交换膜也常用于分离核酸。基于DNA 主链上的带负电荷的磷酸根离子与分子表面上带正电的DEAE 等基团之间相互作用,在低pH 值及低盐浓度下DNA 可与阴离子交换剂结合,可用高pH 值及高浓度的盐溶液来洗脱DNA。洗脱的核酸通常需要乙醇或异丙醇沉淀去除盐。阴离子交换柱得到的核酸纯度很高

[9]
,其缺点是操作繁琐,不适合日常实验要求,常与色谱技术结合,用于超螺旋构型和无内毒素质粒DNA纯化。

2 质粒DNA 纯化中内毒素去除

常规质粒DNA 纯化中,质粒DNA 仍需要从55%蛋白质、20%RNA、3%内毒素和3%基因组DNA中分离

[10-11]
。其中内毒素又称脂多糖,是革兰阴性菌细胞外膜的主要成分
[12]
。脂多糖由疏水的脂质 A 部分、核心寡糖和杂多糖链及菌株特异性O 抗原组成,其中脂质A 是主要活性位点
[13]
。在质粒DNA
制备的菌体裂解过程中,内毒素分子被释放到溶菌液中。由于内毒素常形成囊状结构,其分子量、电荷性和疏水性都与质粒DNA 相似,常用的纯化方法很难将内毒素与质粒DNA 分开。内毒素会降低原代细胞和敏感培养细胞的转染效率,干扰免疫细胞的体外转染。内毒素还会导致机体发热、低血压、呼吸窘迫、血管内凝血及内毒素性休克综合症,内毒素可通过激活TLR4 刺激炎症因子IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α的合成。国家药监局规定,DNA疫苗制品中内毒素含量不得高于0. 01 EU/μg,个人用剂量不超过20 EU。

内毒素去除策略有两种:一是在质粒DNA结合阶段去除;二是质粒DNA洗脱后去除。目前内毒素的去除方法主要包括非选择性去除,如吸附

[14]
、超滤
[15]
和排阻色谱法
[16]
;选择性沉淀,如采用多粘菌素B[
17]
、组胺酸类
[18]
、聚-L-赖氨酸
[19]
亲和层析;此外,还有疏水作用色谱法
[20]
和离子交换色谱法
[21]
。以下介绍几种去除内毒素的方法。

2.1 亲和层析法

多粘菌素B(polymyxin-B,PMX-B)是一种环状亲脂性抗生素,有10 个氨基酸的多肽,其中7 个氨基酸形成环状化合物,在N-端连接一个脂肪链。一般认为多粘菌素B 是通过本身的阳离子与内毒素活性部位磷脂A 的阴离子相结合

[22]
,其作用还包括静电作用、离子作用、亲水作用和其他分子之间的相互作用
[23]
。以PMX-B为配基制成纤维素亲和膜介质,目前主要用于临床血液透析,还可用于内毒素含量检测
[24]

环糊精是环状聚糖,呈管状结构。γ环糊精含8 个单糖,内径0. 85 nm,外侧亲水,内部疏水。脂多糖疏水链距离约0. 49 nm,环糊精可以包裹脂多糖。由于分子筛效应,环糊精不吸附DNA。通过其他分子共聚修饰,可以提高环糊精吸附效率

[25]

2.2 有机试剂萃取法

Triton X-100和Triton X-114是非离子表面活性剂,分子结构中具有亲水的聚乙二醇结构和亲酯的烃结构,是一种两亲物质。内毒素分子的外层结构脂质A 的烷基链与表面活性剂产生非极性相互作用,使内毒素溶解,并同水相隔离。用Triton X-114或Triton X-100从溶液中萃取内毒素时,需要进行多次萃取

[26]

2.3 沉淀法

多价阳离子精胺和亚精胺是核酸凝聚试剂

[27]
。在一定条件下,精胺和亚精胺能与脱氧核糖核酸大沟嵌入结合,与链上的碱基和磷酸基进行链内结合和跨链结合,形成致密的环状螺旋结构。由于精胺和亚精胺主要对DNA 起作用而对RNA 和内毒素作用能力很弱,因此可用于从菌体裂解液中分离质粒DNA,制备医疗级疫苗
[28]

有研究者通过筛选内毒素在不同金属盐中沉淀情况,发现内毒素去除效果依次是Mg

2+
< Ni
2+
< Ca
2+
< Zn
2+
< Cu
2+
,而DNA回收程度是Zn
2+
> Mg
2+
> Ca
2+
> Ni
2+
> Cu
2+
,且SO
4
2-
>Cl
-
。研究结果表明,在中和

后pH环境下,0. 5 mol/L ZnSO

4
在15 ℃孵育30 min可以选择性沉淀80%的内毒素(<0. 05 EU/μg)
[29]

3 质粒DNA 纯化的自动化

目前市面上有很多核酸自动纯化仪,根据提取原理可大致分为离心柱型和磁珠型两种。前者用于提取所有类别的核酸,特别是质粒DNA;后者主要用于提取基因组DNA 及病毒DNA/RNA。由于需离心去除变性的基因组/蛋白质复合体,自动纯化在质粒DNA纯化应用上受到限制。质粒DNA自动纯化仪有两款(表1)。其中,Qiagen QIAcube 核酸自动纯化仪内置有离心机、加热振荡器、移液体系和自动抓取器,需配套相应试剂盒和耗材,适用小提质粒DNA。BenchPro® 2100 适用于大规模质粒DNA 纯化,配套含阴离子交换膜的流体质粒提取卡,采用一系列的捕获和纯化膜收集并裂解大肠杆菌,澄清裂解液,获得转染级质粒。

为了推动质粒DNA 自动化纯化进展,很多研究者尝试优化纯化方法。常规质粒DNA 纯化离心步骤较多且费时,过滤是纯化细菌裂解液较理想的方法,利用过滤柱进行过滤,吸附柱进行核酸吸附,可方便地达到过滤和核酸纯化一体化操作,提高效率

[30]
。基因组/蛋白质复合体絮状沉淀直径约为0. 5~100 μm,使用8 μm 孔径滤膜可基本去除沉淀
[31]
。在高盐环境中,应用0. 45 μm 硝酸纤维素膜从裂解液中去除基因组DNA、RNA 和内毒素,还能用于去除聚乙二醇沉淀重悬后液相物质和离子交换洗脱液中的杂质
[32]
。Millipore 96通道的过滤板可以实现负压抽滤提取300 μL菌液中的质粒DNA
[33]
。由于传统的磁珠法依然需要离心步骤,不适合高通量自动化提取细菌质粒DNA 的发展方向,有研究表明,经特殊修饰的磁珠可通过调节pH 收集菌体并去除絮状沉淀
[34]
。在有些研究中,大肠杆菌可不必从液体培养基中回收而连同培养基一起直接进行裂解处理,这种不需要去掉培养基的微量质粒DNA提取法适用于高通量筛选或测序等工作。

4 展望

质粒是基因工程的重要载体,与病毒载体相比,具有安全性好、毒性低、免疫原性较低以及易于生产等优势,在临床上广泛用于基因治疗和DNA 疫苗的开发。随着对质粒DNA 的深入研究,对质粒DNA 纯化规模和产物纯度提出了更高要求。传统质粒DNA 纯化技术存在着一些亟需解决的问题,包括高通量自动化设备的开发和药用质粒DNA的分离纯化等。

基因疫苗的前期构建需要大量的质粒DNA 筛选工作,传统质粒DNA 纯化方法是在实验室中手工提取,其效率低且存在操作误差,高通量自动化核酸提取和纯化是发展趋势。市场上仅有两款质粒纯化仪,均是柱式法,存在的问题是通量不够。基于磁性纳米粒子的质粒DNA提取方法在高通量自动化上具有一定的优势,不需要柱分离,特别适用于低拷贝质粒DNA,但是目前磁珠法核酸自动纯化仪仅可提取基因组DNA。近年来材料技术的发展,可克服现有技术缺陷,利用不同表面修饰纳米粒子和相应的缓冲体系,为实现质粒DNA快速分离纯化提供基础。

经过分离纯化的质粒DNA 还达不到临床医药标准,需要精细纯化技术。实验室分离纯化的质粒DNA 还包括一些与其性质相似的杂质,如带负电RNA、内毒素、尺寸相近的基因组等。色谱技术为药用质粒DNA 精细纯化提供了基础。利用质粒DNA 的分子量、带电性、疏水性和结构特性与基因组、RNA、内毒素等杂质的差异进行分离,设计和筛选对质粒DNA 选择性更高的亲和配基,联合两个或多个色谱联用技术均可为药用质粒DNA纯化提供解决方案。另外,对于科研用无内毒素质粒DNA,市面上的试剂盒普遍操作繁琐,对纯化后内毒素含量无统一标准,后期应当考虑优化操作和提高质粒DNA回收率。

基金项目:3551光谷人才计划项目(全自动柱式全项核酸纯化仪器的研发及产业化)

文献来源:李卫玲,易初丽. 质粒DNA 纯化及内毒素去除策略研究进展[J]. 江汉大学学报(自然科学版), 2018, 46(1): 62-66.                                                                                                             

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