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蛋白桑:桑叶对肿瘤血管生成的影响

[摘要] 目的 研究桑叶对肿瘤血管生成中血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。 方法 用CCK-8试剂盒测定HUVEC-2C细胞数量的变化;用Transwell转移小室研究HUVEC-2C细胞迁移情况;用包被Matrigel的24孔板来培养HUVEC-2C细胞观察其管腔形成情况。实验分为实验组和对照组,每组分别设置3个复孔,在实验组中加入桑叶浸出液。观察桑叶对肿瘤血管生成的影响。 结果 桑叶液可抑制HUVEC-2C细胞的增殖能力,抑制作用随着浓度的增长而增强。在浓度为100、50、25 mg/mL时,与对照组比较,差异有统计学意义(P   目前,市场上销售的血管生成抑制药物大都成本高昂,作用途径比较单一,治疗不够彻底,副作用仍然较大,在实际应用中存在一些问题。近年来,随着人民生活水平的提高,饮食结构发生了显著变化,世界各地相关学者专家都在极力寻求天然、安全、保健性食品药品的开发,这种回归自然的愿望已成为走向21世纪的趋势。探寻引起不良反应小的植物成分药已成为血管生成抑制剂发展的重要方向[3]。特别是低价易得植物材料,不但可以解决恶性肿瘤早期防治问题,同时也可充分降低治疗成本,给更多癌症患者提供更大的生存机会。 

  桑叶,作为古老的中药,其味甘、性平、寒,具有清肝明目聪耳,镇静神经,润肺热,止咳的作用。近年来,有关学者致力于对天然、安全、保健性药食品的开发,通过对桑叶化学成分及生理功能的研究,发现其含有的黄酮类、生物碱等生物活性成分,具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老等功效,还能预防肿瘤细胞的生成[4-8],被国家卫生和计划生育委员会列为药食两用植物。特别是类黄酮中的槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的分裂增殖,通过多种途径促进其凋亡,抑制肿瘤细胞迁移及侵袭,降低其耐药性等作用[9-13]。笔者从血管生成抑制方面来研究桑叶中有效成分对肿瘤生长的影响。 

  本课题通过探讨低价易得植物材料桑叶中的有效成分对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用,来探索其对肿瘤血管生成的抑制作用,判断桑叶有效成分抑制肿瘤血管生成的可行性,从而为肿瘤早期预防和治疗提供新的方法。 

  1 材料与方法 

  1.1 实验材料 

  桑叶(日本株式会社黑姬和汉药研究所);HUVEC-2C(Cascade biologics公司,批号C-003-2C);PBS(pH为7.4,实验室配制);DMEM高糖培养基(Biowest公司提供);细胞消化液(Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%,Biowest公司提供);胎牛血清(South America Origin,Biowest公司提供);双抗(青霉素-链霉素,碧云天生物研究所提供);CCK-8(上海博谷公司);Matrigel(威格拉斯生物公司提供)。 

  1.2 实验设备 

  超净工作台(SW-CJ-1B,苏州安泰);电子天平(FA2104,上海舜宇恒平);二氧化碳培养箱(CP-ST100A,长沙长锦科技);超声处理仪(JY92-ⅡDN,宁波新芝生物科技股份有限公司);旋转蒸发器(RE-52CS,上海雅荣生公司);酶标仪(DNM-9602G北京普朗公司);倒置生物显微镜(LWD200-37T,上海测维光电)等。镊子;手套;无菌针管;0.22 μm针头过滤器;2 mL PE试管;50 mL离心管;烧杯;量筒;双蒸水;培养皿;离心管;25 mL细胞培养瓶(Corning);96孔细胞培养板(Corning);3 mL巴氏吸管(Corning);Transwell转移小室(Corning);血球计数器。 

  1.3 方法 

  1.3.1 桑叶有效成分的提取[14-15] 精确称取桑叶粉3.00 g,浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20~25 kHz超声频率下超声30 min后过滤,并将滤渣用60 mL 75%的乙醇再次超声30 min。将得到的两次滤液合并超声混匀,再用0.45 μm的滤纸过滤。滤液用旋转蒸发器在0.08 mPa、60℃的环境下蒸发2.5 h以去除乙醇,得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤除菌,最终得到的桑叶液浓度为100 mg/mL,依次两倍梯度稀释至50、25、12.5 mg/mL。 

  1.3.2 细胞培养 实验中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清,1%双抗)进行培养,用含0.25%胰蛋白酶(0.02% EDTA)消化传代。二氧化碳培养箱环境设置为5%CO2,37℃。 

  1.3.3 增殖实验 取对数生长期HUVEC-2C,进行消化、计数,控制细胞数量至5×104个/mL。在96孔板中设实验组(100、50、25、12.5 mg/mL)、阳性对照组、阴性对照组,每组设3个复孔,在实验组和阳性对照组中分别加入每孔100 μL的细胞悬液,阴性对照组加入100 μL培养基。在96板内培养HUVEC-2C 8 h直至细胞完全贴壁。在实验组中分别加入10 μL不同浓度桑叶制备液(100、50、25、12.5 mg/mL),阳性对照组、阴性对照组加入10 μL无血清的培养基。培养24 h之后将96孔板置于倒置显微镜下观察,发现细胞无异常生长情况,再在每孔中加入10 μL CCK-8检测试剂,1 h后用酶标仪在单波长450 nm处检测OD值。OD值与细胞密度成正比,OD值越大说明细胞密度越大,反之则越小。 

  1.3.4 迁移实验 取对数生长期HUVEC-2C,进行消化、重悬后计数,调整细胞数量至1×106/mL。在Transwell转移小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液,下室加600 μL无血清DMEM培养基。细胞培养8 h后,在实验组的下室加100 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液,对照组加100 μL无血清DMEM培养基,每组设3个复孔。将Transwell转移小室置于5%CO2,37℃二氧化碳培养箱中培养8 h后,用PBS清洗小室内侧,棉球擦去上室内侧中的细胞。小室外侧细胞用无水酒精固定30 min,结晶紫染色30 min。洗净后置于倒置生物显微镜下观察、拍照并分析。 

  1.3.5 管腔形成实验 用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板,室温下放置30 min使Matrigel凝固。取出对数生长期的HUVEC-2C,消化、重悬后计数,调整细胞数量至5×105/mL。实验组和对照组每孔接种500 μL细胞悬液。此外,对照组不加桑叶浸出液,实验组加50 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液,每组设置3个复孔。将24孔板放入5%CO2,37℃培养箱中培养,8 h后置于倒置生物显微镜下观察,随机选3个视野拍照。   

1.4 统计学方法 

  采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。

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